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  • 多肽藥物非臨床安全性評估的介紹

    2021-01-18 10:16:46

    本文主要根據期刊文章《Mitra等(2020)Regulatory Toxicology and Pharmacology, 117 以非臨床安全性評估的觀點探討治療性多肽產品的開發》、及《Ypsilanti(2018)Health Sciences Eastern Michigan University, 有關合成肽臨床前測試的法規問題》整理而成。

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    多肽是一類獨特的藥物,也是全球醫藥的重要治療方法。自1920年全世界第一個多肽胰島素被發現,其后的產品包括激素替代品(胰島素和促腎上腺皮質激素)、天然來源分離出的抗菌素(桿菌肽,短桿菌肽D和多粘菌素B)被陸續開發出來。

    從1970年代開始,合成激素類似物(莎拉欣,去氨加壓素和促性腺激素)成為治療性多肽產業的主要關注點,而如今,重組技術已用于制造激素替代品(甲狀旁腺激素和胰高血糖素)和類似物(杜拉魯肽,胰島素類似物和 Teduglutide),可用于眾多治療領域。截至2021年已有100多種肽被批準用于人類。通常,多肽是化學合成的,是來源于細胞并由生物技術衍生的,或者是從天然產物中分離出來的,然后通過向重組產物中添加脂質結合物或通過對天然衍生產物的化學修飾。

    多肽類藥物涵蓋眾多不同種類的多肽分子,并以多種方式制造,也包括非多肽類的修飾(non-peptide modifications)。盡管多肽藥物的確切定義是一個有爭議的問題,但基于多肽的療法,多肽長度的范圍可以從3到100個氨基酸(amino acids,AA)。

    多肽藥物結構上介于小分子和蛋白質之間,具有高特異性和低毒性的獨特優勢。在鑒定與疾病發病機理有關的新受體和靶標方面,獨特且有價值的完整的多肽全庫結合高通量篩選(HTS)的技術已被成功的發展出,此技術對多肽的篩選發現苗頭化合物用于治療疾病上邁出重要的一步。

    然而,某些多肽內在特性,例如代謝不穩定和需要腸胃外給藥途徑,是多肽藥物開發及成藥性的主要障礙。以上的這些障礙可以用化學合成的多肽通過使用非蛋白氨基酸(non-proteogenic amino acids)改善代謝穩定性來克服這些挑戰,或者使用化學藥品(例如聚乙二醇, PEG)增強穿膜運輸。

    此外,多肽開發的最具挑戰性的階段是臨床前階段。由于多肽不能像小分子那樣通過擴散到達細胞靶標,亦不能通過細胞膜后,直接與胞內受體結合而發揮作用,因此通過體外和體內試驗來確定其藥理和藥代動力學試驗極具有挑戰性。

    與任何其他生物技術一樣,多肽的開發和安全性評估也面臨著各種復雜的挑戰。其中包括在多肽療法的開發過程中,缺乏監管法規導致了幾個問題。這些問題包括但不限于–在開發化學合成的與生物技術衍生的肽時需要遵循的監管法規、毒理學實驗動物模型選擇的策略、遺傳毒性和免疫原性評估是否具有附加價值,是否需要對含有非蛋白氨基酸的肽進行額外的毒理學研究。

    因為全球缺乏針對多肽開發的具體醫事注冊監管法規,該類藥物的非臨床安全性評估只能主要依賴于將現有的小分子藥物[國際協調聯盟 ICH S1-S5, S7-S8, M3 (R2)]和生物制藥的 [ICH S6 (R1)]醫事注冊監管指導法規,但是針對多肽的指導法規仍然有限。

    先前的美國食品藥品監督管理局(US FDA)注冊法規指出,細胞培養產生的所有蛋白質和多肽產品,除抗生素和激素產品外,均應作為生物制劑進行審查。FDA CDER部門審查了當前數據集中的絕大多數肽。唯一的例外是Fc或白蛋白融合物(阿比魯肽,杜拉魯肽,romiplostim),阿卡侖肽,新型60AA重組激肽釋放酶抑制劑和甲狀旁腺激素(84 AA),因為它們被認為是激素產品。

    FDA在2020年3月更改了多肽類藥物的分類,當時生物制劑價格競爭和創新(BPCI) 法案正式宣布,大于40AA的重組分子,無論其藥理學如何,都將被視為蛋白質生物制劑,而無論生產方法的所有小于 40 AA 多肽類,都將遵循新藥申請 (NDA) 途徑。

    本報告的借由1998年至2019年在美國治療性多肽產品獲得批準摘要 (Summary basis of approval, SBA) 分析,包括總共47種多肽外,有49% 是化學合成的,有40%是通過生物技術合成的,有13%是半合成制造的,1% 是從天然來源獲得的。

    為了深入了解治療性多肽的醫事注冊法規要求,在治療性多肽產品批準摘要分析下,發現其研發模式,遵循的醫事注冊監管法規以及毒理學實驗動物模型選擇的策略,其中包括:遺傳毒性和免疫原性評估的要求,雜質、代謝物和安全藥理學評估,含有非蛋白氨基酸(NPAA)的多肽的安全性和安全性評估。其非臨床毒理學發展策略如下:

    一般毒理學

    根據當前ICH指導法規的措辭,化學合成和生物技術衍生的多肽似乎屬于 ICH S6(R1 )法規。但是,從獲得批準治療性多肽產品中可以清楚地看出,實際上多肽藥物總是使用類似ICHM3(R2)的小分子藥物方法開發的。這包括在嚙齒動物和非嚙齒動物物種中進行一般毒性研究,基于最大耐受劑量(MTD)設置高劑量的非臨床毒理學研究 (包括之后評估遺傳毒性、發育毒性和生殖毒性),而不是考慮效價、結合親和力、靶標結合和/或受體占有率 (RO)。

    雖然ICH M3(R2)醫事注冊指導法規明確指出治療性多肽產品在本法規的范圍之外,而ICH S6(R1)指導法規建議在該法規的原則下開發化學合成或重組的多肽藥物。但是,獲得批準治療性多肽產品不管采用何種多肽合成方法,大多數均按照ICH M3(R2)指導法規,在所有肽的嚙齒動物 (大鼠) 和非嚙齒類動物 (狗或食蟹猴)中進行了常規毒理學研究,在研究中探索并提供的最高劑量是基于最大耐受劑量或極限劑量。

    通常,慢性毒理學研究的持續時間遵循ICH S4的指導。嚙齒類動物研究通常持續時間為≥6個月,同樣的非嚙齒類動物研究也持續時間為≥9個月,若急性或較短的臨床給藥方案可以選用持續時間較短的慢性毒理學研究。

    發育和生殖毒理學 (DART)

    由于治療性多肽藥物可作為激素的類似物或拮抗劑,加上激素在許多情況下是生殖發展和胎兒發育過程所必需的,因此發育和生殖毒理學研究被認為對治療性多肽藥物的安全評估是事關重要的。所以針對所有治療性多肽藥物應該進行了 Seg I 嚙齒動物的生殖毒理研究,Seg II 嚙齒動物和兔子的胚胎-胎兒發育的生殖毒理研究以及Seg III 嚙齒動物的產前和產后發育的生殖毒理研究。

    此外,生殖毒理學還對治療性多肽藥物進行了幼體毒性研究。根據 ICH S6(R1)注冊指導法規,生物制藥要求在非人類靈長類 (NHP) 動物中進行主要生殖毒理學研究。但是在獲得批準重組多肽藥物注冊審批過程中發現,在生殖毒理學實驗上,醫事注冊監管機構尚無對多肽藥物藥理學相關實驗動物模型的選擇做進一步的討論。

    多肽藥物含有非蛋白氨基酸

    非蛋白氨基酸可以是天然存在(例如肌氨酸,鳥氨酸或D-丙氨酸),也可以是非天然存在(例如1-萘基丙氨酸,4-氯-D-苯丙氨酸或芐基酪氨酸)。在多肽藥物中,為了改善多肽對靶標結合親和力或穩定性,非蛋白氨基酸通常加入多肽中。

    在1998年后獲得批準的47種多肽藥物中,有45%至少包含一種非蛋白氨基酸,其中有17%至少包含一種非天然的非蛋白氨基酸,而且這些多肽制劑大多數具有包含一個以上的非蛋白氨基酸。

    從理論上講,該多肽一旦被代謝就可以釋放出非蛋白氨基酸,然后可以將其摻入體內的內源性蛋白質中。當非蛋白氨基酸存在于肽治療劑的結構中時,即使這些非蛋白氨基酸沒有使用先例,醫事注冊監管機構也未要求進行其他毒理學研究。唯一的例外是非蛋白氨基酸也以雜質形式存在于原料藥或藥品中。

    所以對于絕大多數的(天然或非天然)非蛋白氨基酸,即使在以前批準的多肽藥物在從未使用過非蛋白氨基酸的情況下,極為罕見對于獨立的非蛋白氨基酸進行專門的遺傳或一般毒理學研究。

    在兩個獲得批準多肽藥物中,醫事注冊監管機構要求申辦方的對聯氨苯吡啶多肽藥物 (bivaluridine) 必須在大鼠中進行了急性和重復劑量毒性研究,因為其中有2種非蛋白氨基酸原料藥(DS)以的雜質形式存在。

    對于依卡替班多肽藥物 (icatibant),在2種非蛋白氨基酸原料藥中發現雜質情況下,醫事注冊監管機構要求申辦方進行了單劑量體內毒理學研究和遺傳毒理學研究 (細菌反向突變試, Ames test)。

    免疫原性 (ADA) 評估

    化學合成和重組的多肽治療劑,就像蛋白質一樣,具有誘導人類免疫原性應答的潛力。如果多肽藥物基于任何內源性蛋白質中都不存在的 AA 序列的話,則抗藥物抗體 (ADA) 的產生會導致功效喪失和清除率改變。在大多數情況下,這將意味著增加劑量水平或改用其他藥物。

    但是,當多肽藥物是內源蛋白質的類似物或與內源蛋白質的序列有明顯重疊時, ADA 抗體的產生可能意味著針對此類內源蛋白質的抗體,若這一個問題存在的話,這將是一個重大的安全問題。

    在 1998 年后獲得批準多肽藥物中,有 67% 多肽藥物在非臨床或臨床研究中有評估ADA。評估了免疫原性的多肽藥物中,在非臨床、臨床研究中分別有 62%、87% 的 ADA 呈陽性,但非臨床 ADA 測試在預測臨床 ADA 陽性結果敏感度的僅為 72%。

    在過去的十年中, ADA 測定的靈敏度以及在血清中存在過量藥物的情況下測量 ADA 的方法已有所改善,因此, 2007 年后幾乎測試的每種多肽藥物的 ADA 都成呈陽性反應。產生 ADA 的多肽藥物氨基酸長度范圍為 8 到 84。

    另外,在臨床上具有 ADA 陽性的多肽藥物中,大多數 (66%) 不包含非蛋白氨基酸。這表明多肽藥物的氨基酸長度和非蛋白氨基酸的存在均未對其免疫原性產生明顯影響。在臨床上對 ADA 測試呈陽性的藥物中,有 90% 的病例沒有對藥物的藥代動力學 (PK) 或對藥效產生影響。

    盡管尚未建立 ADA 測試在非臨床物種中與臨床反應的相關性,但在藥物顯示非臨床 ADA 呈陽性的所有情況下,它在臨床中也大都會呈 ADA 陽性。在臨床上對 ADA 進行非臨床評估的藥物中,有 72% 的抗藥物抗體陽性,而在臨床中 87% 的 ADA 藥物呈陽性,這表明肽類藥物產生抗體的傾向很高。

    但是,在臨床上已觀察到 ADA 陽性反應的90%的病例中,未觀察到對 PK 或功效的影響,即使在 ADA 影響藥效學讀數的兩種情況下,在臨床試驗中也僅占受試者的一小部分,這似乎并不是一個重大的安全隱患。但仍建議在多肽藥物的開發使用相關且靈敏的檢測方法來監控 ADA 的形成。

    雜質鑒定

    根據現有醫事注冊監管指導法規,多肽藥物質量檢查標準是依據在小分子藥物 [ICH Q3A (R2) 和ICH Q3B (R2)] 指導法規、或依據生物制藥指導法規 (ICH Q6B)有關原料藥及藥物中雜質和降解物的標準,尚未定論。

    多肽藥物申辦方對化學和半合成生產的 57% 多肽中進行了獨立的雜質和降解物鑒定研究。其中包括體外遺傳毒性試驗以及使用“加標”或降解批次的一般毒性研究。

    對于依卡替班多肽藥物,申辦方被要求按照基于多肽雜質的鑒定和鑒定閾值進行 3 個月的雜質鑒定研究,而不是 ICH 雜質鑒定指南文件中提到的傳統閾值。所以,建議未來多肽重組藥物可能需要降解物鑒定研究。例如,對于胰島素地高盧德和德特米爾胰島素,對此類型的多肽藥物進行了為期 1 個月的大鼠降解資格研究。

    因為缺乏關于多肽藥物雜質的明確指導法規,并且在 ICH Q3A(R2)法規特別標明多肽類不在管轄范圍之內。盡管與多肽藥物工藝有關的小分子雜質,可能存在于合成或半合成肽中,但這些雜質通??梢酝ㄟ^現代制造技術輕松控制。

    相比之下,在多肽合成過程產生的多肽相關的雜質更是一個問題,由于它們與藥物本身結構相似,以及與傳統的小分子相比較大的,相對復雜的肽分子結構,所以這些與多肽的雜質難以檢測、定量和控制。

    重組肽可以使用類似 ICH Q6B 指導法規的方法將這些雜質作為產物異質性處理,但是化學合成的肽很可能包含相似的異質性,同時仍保留了傳統的以小分子為重點的雜質指導原則。在這種情況下,需要采取更加細致和靈活的方法來處理多肽藥物的雜質問題。

    生物轉化和藥代動力學評估

    對所有化學合成和半合成多肽藥物進行了詳細的生物轉化研究,這些研究包括多肽藥物體外代謝和活性的研究、代謝物的結構表征以及體內代謝動力學和毒理學研究中代謝物的定量研究。其中僅對幾種重組多肽藥物采用了甘精胰島素和甘精胰島素的放射性標記多肽,進行非臨床體內代謝物分析。

    此外,這些人類多肽代謝物水平皆低于在非臨床實驗動物的水平,所以沒有進行任何多肽獨立的代謝物安全性評估研究。并且 ICH S6(R1) 法規特別指出,生物技術來源的藥物會降解為小肽和單個 AA,因此,其代謝途徑都充分被理解,因此認為其生物轉化研究不是必需的。

    除了一個例外情況 ,若多肽主要代謝物會影響到藥理反應,建議執行非臨床和臨床研究中對其進行主要代謝物的定量分析,以了解其對藥物藥理學的影響。

    遺傳毒性評估

    根據 ICH S6(R1) 法規,重組產品無需進行基因毒性評估,因為重組產品不會直接與 DNA 或其他染色體材料發生相互作用。但是在 1998 年后獲得批準多肽藥物中,對所有化學合成、半合成衍生和天然多肽藥物進行了完整標準遺傳毒性評估(包括體外細菌 Ames 以及體內和體外染色體畸變測試)。

    因此,對于為什么對重組多肽藥物進行遺傳毒性評估,原因尚不清楚。在獲得批準的多肽藥物中,無論用何種方法合成的多肽藥物,都對大多數多肽(包括重組肽)進行了遺傳毒性評估,最終的結果判定為沒有遺傳毒性。

    另一種可能的情況是,當使用 Ames 分析法來評估化學合成或半合成多肽藥物時,因為多肽合成過程所產生的雜質可能會產生潛在的遺傳毒理反應。

    光毒性評估

    多肽藥物的光毒性評估是使用在 3T3 中性紅吸收試驗,對多肽進行光毒性潛能的體外評估。但是,歐洲醫學協會實驗指出多肽藥物具有一些紫外線吸收的趨勢(通常在 280 nm處出現峰,在 290 nm 處出現肩峰)。

    因為多肽中的芳香族氨基酸可作為生色團。這與任何光毒性無關,并且通常不需要對多肽藥物進行光安全性測試。此外,根據 ICH S10法規,多肽藥物不在法規適用的范圍。因此,不建議多肽藥物治療劑進行光毒性評估。

    安全藥理學

    在ICH S6(R1)和ICH S7A&B法規中提供了有關生物制劑和小分子藥物的具體指南。但是多肽藥物的在安全藥理試驗的評估中,沒有具體法規規定多肽藥物必須進行 hERG 抑制作用測試和進行全面QT評估。

    在1998 年后獲得批準的多肽藥物中,發現NDA中提交的49%多肽藥物執行 hERG 分析評估,于2005年在ICH S7B法規發布后,所提交的69%獲得批準的多肽藥物中,包含特定的 hERG分析。當前不建議對在生物許可證申請 (BLA) 下提交的多肽藥物進行 hERG分析。

    有趣的是,作為BLA提交的67%的多肽藥物,在其數據包中包含了hERG分析。在心血管安全藥理研究中,無論以 NDA 還是 BLA 形式提交的多肽藥物,所提交的40%獲得批準的多肽藥物中,使用大鼠、狗或非人類靈長類動物進行的心血管安全藥理研究。

    但多肽藥物中只有不到一半是在臨床全面 QT 研究中進行評估的,尚不清楚采用什么標準來納入或省略這些研究。目前為止已批準的多肽藥物中,尚未發現具有確定的 QT 間隔延長的多肽藥物。

    致癌性評估

    根據ICH S1法規,致癌性評估必要在兩種非臨床嚙齒動物模型中進行多肽藥物試驗。使用了15%和35%獲得批準的多肽藥物在一種和兩種嚙齒動物中分別進行了致癌性研究,由于所有多肽藥物均不具有遺傳毒性,觀察到約 50% 的致癌性可能是嚙齒動物模型中藥理夸大的結果。由于多肽藥物本質上是沒有遺傳毒性,因此,建議在進行致癌性研究之前,應先測試嚙齒動物中多肽的藥理活性,并與醫事注冊監管單位進行充分溝通。

    總之,本寫意報告旨在介紹多肽藥物非臨床安全性測試相關的醫事注冊監管單位意見,并強調多肽類藥物監管方式的主要差異,以及提供其發展所需的毒理學、安全藥理學和免疫原性評估的期望。

    在多肽治療藥物的開發方面存在很大的歧義,此報告的分析為多肽治療藥物的非臨床開發提供了一個通用框架,并突顯了醫事注冊監管單位需要針對多肽治療藥物在遺傳毒性、雜質、代謝產物和非蛋白氨基酸評估等方面建立特殊法規。

    本報告的另外一個目的是分析獲得批準的多肽類藥物的非臨床毒理學發展范例,提供資訊給中國多肽藥企在美國注冊治療性多肽產品的公認法規要求,以期了解用于支持其多肽類藥物在美國注冊的研究和策略的制定。

    此文引自于:同寫意

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